Tuyển chọn chủng bacillus đa hoạt tính trong sản xuất phân bón vi sinh vật chức năng cho cây khoai tây

Tuyển chọn chủng bacillus đa hoạt tính trong sản xuất phân bón vi sinh vật chức năng cho cây khoai tây

Thể loại: Báo cáo khoa học
Lượt xem: 46,297Lượt tải: 8Số trang: 6

Mô tả tài liệu

Lựa chọn vi khuẩn Bacillus có nhiều hoạt tính sinh học sẽ đóng một vai trò quan trọng trong việc sản xuất và ứng dụng của phân sinh học chức năng. Bài viết này cho thấy vi khuẩn Bacillus B16 đã được lựa chọn. Nó có thể được đối kháng bệnh héo vi khuẩn do Ralstonia solanacerum và sản xuất tăng trưởng chất thúc đẩy nhà máy (IAA). Bởi thuộc địa đặc trưng, hình thái tế bào, và trình tự của DNA mảnh vỡ của 16S rRNA gen các chủng B16 được xác định là vi khuẩn Bacillus subtilis. Theo Cộng đồng châu Âu, loài...

Tóm tắt nội dung

TUYỂN CHỌN CHỦNG Bacillus ĐA HOẠT TÍNH TRONG SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH VẬT CHỨC NĂNG CHO CÂY KHOAI TÂY Đào Văn Thông, Nguyễn Thu Hà, Phạm Văn Toản, Phạm Thu Thủy SUMMARY of bacillus has multi using for potato Bacillus has multi will play an important role in the and of This paper showed that Bacillus B16 was selected. It can be wilt caused by Ralstonia and produce plant growth promoting substance (IAA). By colony cell and of DNA fragment of 16S rRNA gene the B16 strain was as Bacillus subtilis. According to European species are selected have high biosafety and they are to apply in common. The Bacillus subtilis B16 will be research to apply for of Bacillus subtilis, Ralstonia bacterial wilt, potato. I. §ÆT VÊN §Ò Khoai tây là cây lương thực, cây thực phNm có giá trị. Ở nhiều nước thuộc châu Âu, châu Mỹ, khoai tây được coi là một loại lương thực chính sau lúa mì, ngô. Diện tích trồng khoai tây ở Việt Nam có khoảng 35.000 - 37.000 ha và sản lượng đạt 420.000 - 450.000 tấn. Một trong những nguyên nhân làm giảm năng suất, chất lượng khoai tây là bệnh héo xanh do vi khuNn Ralstonia gây nên. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có biện pháp hữu hiệu nào có thể ngăn chặn và phòng trừ bệnh này. Nghiên cứu trước đây cho thấy nhiều loài thuộc chi Bacillus có nhiều hoạt tính sinh học như ức chế vi sinh vật gây bệnh và sinh tổng hợp hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật. Bài báo trình bày kết quả nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuNn Bacillus để sản xuất phân bón sinh học cho khoai tây có khả năng hạn chế bệnh héo xanh vi khuNn II. VËT LIÖU Vµ PH¦¥NG PH¸P NGHI£N CøU 1. Vật liệu nghiên cứu - Chủng vi sinh vật: Gồm 15 chủng Bacillus và 01 chủng Ralstonia (gây bệnh héo xanh cây khoai tây, ký hiệu VKHX) do Quỹ gen Vi sinh vật trồng trọt - Viện Thổ nhưỡng Nông hoá cung cấp. - Giống khoai tây: Giống khoai tây Solana, là giống mẫn cảm với bệnh héo xanh vi khuNn do Trung tâm nghiên cứu cây có củ - Viện Cây lương thực và Cây thực phNm cung cấp. 2. Phương pháp nghiên cứu - Xác định đặc điểm hình thái khuNn lạc, tế bào của chủng vi sinh vật bằng các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học thông dụng. - Xác định mật độ vi sinh vật theo phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa theo TCVN 4884 - 2005. - Xác định khả năng ức chế vi khuNn gây bệnh héo xanh bằng phương pháp khuyếch tán trên môi trường thạch theo 10 TCN 714 - 2006. - Xác định khả năng sinh tổng hợp IAA thô theo phương pháp Salkowsky cải tiến: Xác định hàm lượng IAA tạo ra trong môi trường nuôi cấy có bổ sung 0,1% so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 530 nm với đồ thị IAA chuNn. - Xác định tên và mức độ an toàn sinh học của các chủng Bacillus bằng phương pháp phân loại sinh học phân tử, dựa trên cơ sở giải trình tự gen 16s ARN ribosome, so sánh với các trình tự có sẵn trong ngân hàng gen quốc tế EMBL bằng phương pháp FASTA 33 và xây dựng cây phát sinh chủng loại. Tên vi sinh vật được xác định với xác xuất tương đồng cao nhất. - Thí nghiệm đánh giá hoạt tính đối kháng vi khuNn gây bệnh héo xanh vi khuNn trên cây khoai tây: Đất trồng cây thí nghiệm là loại đất phù sa sông Hồng đã được khử trùng. Thí nghiệm được trồng trong nhà lưới, bố trí ngẫu nhiên, 3 lần nhắc lại, 18 cây/lần nhắc. Công thức thí nghiệm: CT1: Nhiễm VKHX (108 CFU/củ giống). CT2: Nhiễm B05 và VKHX (108 CFU/củ giống, tỷ lệ nhiễm 1:1). CT3: Nhiễm B08 và VKHX (108 CFU/củ giống, tỷ lệ nhiễm 1:1). CT4: Nhiễm B16 và VKHX (108 CFU/củ giống, tỷ lệ nhiễm 1:1). CT5: Nhiễm B18 và VKHX (108 CFU/củ giống, tỷ lệ nhiễm 1:1). Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ cây nhiễm bệnh (%) sau trồng 30 ngày. - Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của Bacillus đến sinh trưởng của cây khoai tây: Đất trồng cây thí nghiệm là loại đất phù sa sông Hồng đã được khử trùng. Thí nghiệm được trồng trong nhà lưới, bố trí ngẫu nhiên, 3 lần nhắc lại, 10 cây/lần nhắc. Công thức thí nghiệm: CT1: Đối chứng (không nhiễm vi sinh vật). CT2: Nhiễm Bacillus (107 CFU/củ giống). Chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao cây, trọng lượng tươi thân lá, trọng lượng khô thân lá của cây khoai tây sau trồng 30 ngày. III. KÕT QU¶ Vµ TH¶O LUËN 1. Tuyển chọn chủng Bacillus Từ các chủng Bacillus do nguồn gen vi sinh vật nông nghiệp đã xác định hoạt tính đối kháng vi sinh vật gây bệnh héo xanh vi khuNn đối với cây khoai tây và hoạt tính sinh tổng hợp hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật (IAA). Kết quả được tập hợp tại bảng 1. Bảng 1. Hoạt tính sinh học của các chủng Bacillus TT Ký hiệu chủng Bacillus Khả năng đối kháng VK gây bệnh héo xanh (Đường kính vòng ức chế vi khuẩn D - d, mm) Khả năng sinh tổng hợp IAA thô (Hàm lượng IAA thô, µµµµg/ml) 1 B01 - - 2 B03.2 6 71 3 B05 15 185 4 B06 3 49 5 B07 - 157 6 B08 15 186 7 B09 6 <10 8 B10 - 257 9 B11 - - 10 B12 - - 11 B13.1 - 14 12 B13.2 - 71 13 B15 - 22 14 B16 22 133 15 B18 15 263 Ghi chú: “ - ” Không có hoạt tính Kết quả bảng 1 cho thấy: - 7/15 chủng Bacillus nghiên cứu có hoạt tính đối kháng vi khuNn gây bệnh héo xanh khoai tây. Trong đó bốn chủng có đường kính ức chế vi khuNn gây bệnh héo xanh trên 15 mm (B18, B16, B08 và B05); đặc biệt chủng B16 có đường kính ức chế vi khuNn gây bệnh héo xanh cao nhất (đạt 22 mm). - 12/15 chủng Bacillus nghiên cứu có hoạt tính sinh tổng hợp IAA. Trong đó 5 chủng có hàm lượng IAA hình thành đạt trên 100 µg/ml (B18, B16, B10, B08, B07 và B05). - Từ kết quả trên, 4 chủng B18, B16, B08 và B05 đã được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Với mục đính sử dụng chủng Bacillus trong kiểm soát bệnh héo xanh vi khuNn đối với cây khoai tây, tiếp tục đánh giá hoạt tính đối kháng vi khuNn gây bệnh héo xanh của các chủng Bacillus lựa chọn trên cây trồng. Kết quả được thể hiện trong bảng 2. Bảng 2. Khả năng đối kháng VKHX của các chủng Bacillus tuyển chọn trên cây khoai tây Chỉ tiêu theo dõi Công thức Cây bị bệnh (%) Cây bị bệnh so với đối chứng (%) Mức độ hoạt tính đối kháng CT1 (ĐC nhiễm VKHX) 66,6 - - CT2 (B05 + VKHX) 25,7 38,6 Khá CT3 (B08 + VKHX) 28,9 43,4 Khá CT4 (B16 + VKHX) 16,7 25,1 Cao CT5 (B18 + VKHX) 20,5 30,8 Khá Kết quả bảng 2 cho thấy, 4 chủng nghiên cứu đều có khả năng ức chế VKHX, tỷ lệ cây bị bệnh so với đối chứng từ 25,1 đến 38,6 %. Dựa theo 10 TCN 714 - 2006, chủng B16 có mức độ hoạt tính đối kháng cao (tỷ lệ cây bị bệnh so với đối chứng < 30 %). Dựa vào kết quá đánh giá hoạt tính đối kháng VKHX cây khoai tây của các chủng Bacillus trong điều kiện phòng thí nghiệm và trên cây trồng, đã tuyển chọn được chủng B16 có hoạt tính đối kháng VKHX cây khoai tây cao. Ngoài ra, chủng B16 còn có hoạt tính sinh tổng hợp hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật. Tính đa chức năng của chủng B16 có ý nghĩa trong việc nghiên cứu sử dụng để sản xuất phân bón vi sinh vật chức năng cho cây khoai tây. 2. Xác định tên, mức độ an toàn sinh học của chủng B16 2.1. Phân loại dựa trên đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào Bảng 3. Đặc điểm hình thái khu0n lạc, tế bào của chủng B16 Đặc điểm Chủng B16 Gram (+) Đặc điểm khuẩn lạc Dạng mép răng cưa, bẹt, hơi nhăn, trắng đục, kích thước khuẩn lạc 1,2 - 1,5 cm Đặc điểm tế bào Dạng hình que, bào tử hình elip Khả năng di động Chuyển động chậm Dựa vào đặc điểm khuNn lạc và tế bào cho thấy chủng B16 có nhiều đặc điểm giống Bacillus subtilis. 2.2. Phân loại dựa trên giải trình tự đoạn ADN 16S riboxom Kết quả giải trình tự đoạn 16S ADN riboxom của chủng B16 có 99,3% tương đồng với Bacillus subtilis. Trình tự nucleotid đoạn ADN 16S ribosome của chủng B16 như sau: Hình 1. Cây phát sinh chủng loại được hình thành trên cơ sở so sánh trình tự nucleotid đoạn AD? 16S ribosome của chủng B16 với trình tự nucleotid đoạn AD? 16S ribosome của Bacillus subtilis phân lập ở các nước khác nhau trên thế giới. DE: CHLB Đức; KR: Hàn Quốc; QT: Bacillus subtilis chủng Quốc tế, được các nước hợp tác giải mã toàn bộ genom; JP: ?hật Bản. Độ an toàn sinh học của chủng Bacillus subtilic. T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 5 2.3. Độ an toàn sinh học của chủng Bacillus subtilis Độ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật sử dụng trong đời sống có ý nghĩa đặc biệt quan trọng. Theo hướng dẫn số ngày 26 thàng 11 năm 1990 của Cộng đồng châu Âu về an toàn sinh học, nhóm tác nhân sinh học “Vi khuNn” được phân làm 4 cấp độ an toàn, trong đó chỉ các vi khuNn ở cấp độ 1 và 2 được ứng dụng trong sản xuất ở điều kiện bình thường. - Cấp độ 1 (Risiko gruppe 1) là các vi khuNn không thể gây bất cứ một nguy hiểm nào đối với người và động vật - Cấp độ 2 (Risiko gruppe 2) là các vi khuNn có thể gây bệnh đối với người, động vật ở mức độ thấp, không có khả năng lan truyền và có thể phòng, chống và loại trừ dễ dàng trong điều kiện bình thường. - Cấp độ 3 (Risiko gruppe 3) là các vi khuNn có nguy cơ gây bệnh nặng đối với người, động vật và có khả năng lan truyền rộng, song vẫn có thể phòng chống và loại trừ được. - Cấp độ 4 (Risiko gruppe 4) là các vi khuNn có thể gây bệnh nặng đối với người, động vật, có nguy cơ lớn về mức độ lan truyền rộng và không thể phòng, chống hoặc loại trừ. Kết quả so sánh với danh mục các vi khuNn an toàn của CHLB Đức và Cộng đồng Châu Âu cho thấy chủng Bacillus subtilis B16 thuộc nhóm vi khuNn có độ an toàn cao (cấp độ 1). Như vậy, chủng B16 lựa chọn là chủng vi sinh vật bảo đảm an toàn sinh học; có thể sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh vật. 3. Đánh giá ảnh hưởng chủng B16 đến sinh trưởng và phát triển của cây khoai tây Kết quả đánh giá ảnh hưởng của chủng B16 đến sinh trưởng của cây khoai tây sau 30 ngày trồng được thể hiện trong bảng 4. Bảng 4. Ảnh hưởng của chủng B16 đến sinh trưởng và phát triển của cây khoai tây Công thức Chiều cao cây (cm) Trọng lượng tươi thân lá (g) Trọng lượng khô thân lá (g) CT1 (ĐC) 39,70 40,80 3,92 CT2 (nhiễm B16) 43,20 44,95 4,43 CV% LSD0,05 4,10 3,867 4,20 4,097 4,40 0,419 Kết quả bảng 4 cho thấy, ở công thức nhiễm B16 (CT 2), chiều cao cây, trọng lượng tươi và trọng lượng khô thân lá đều cao hơn so với đối chứng. Điều này cho thấy, chủng B16 có ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng và phát triển của cây khoai tây. Như vậy, từ các kết quả trên cho thấy chủng Bacillus subtilis B16 có khả năng kiểm soát bệnh héo xanh vi khuNn và có ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng, phát triển của cây khoai tây. Chủng Bacillus subtilis B16 sẽ được giới thiệu cho sản xuất phân bón vi sinh vật chức năng cho cây khoai tây. IV. KÕT LUËN - Từ 15 chủng Bacillus nghiên cứu đã tuyển chọn được chủng Bacillus subtilis B16 có hoạt tính đối kháng vi khuNn gây bệnh héo xanh cho cây khoai tây cao, có khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật (IAA); đồng thời là chủng vi sinh vật có mức độ an toàn sinh T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 6 học cao (cấp độ 1). Đây là chủng vi sinh vật có giá trị sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh vật chức năng. - Thử nghiệm trên cây khoai tây cho thấy, chủng Bacillus subtilis B16 có khả năng hạn chế bệnh héo xanh vi khuNn, tăng khả năng sinh trưởng và phát triển đối với cây khoai tây. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. 10 TCN 714:2006 Phương pháp đánh giá hoạt tính đối kháng của vi sinh vật có khả năng đối kháng vi khuNn Ralstonia gây bệnh héo xanh cây trồng cạn. 2. Bais HP, Fall R and Vivanco JM (2004), of Bacillus subtilis against infection of roots by syringae is by biofilm formation and surfactin Plant Physiol. 134, 307 - 319. 3. Borriss R (2002), phytase activity of Bacillus FZB45 to its plant - growth - promoting effect. 148, 2097 - 2109. 4. J, Reva O and Meijer J (2007), of oilseed rape (Brassica napus) toward fungal pathogens by strains of plant - Bacillus Microb. Ecol. 54, 134 - 140. 5. Idriss EE, O, Farouk A, Rosner K, Greiner R, Bochow H, Richter T and Jacobsen B, Zidack N and Larson B (2004), The role of Bacillus based control agents in pest systems: Plant diseases. 94, 1272 - 1275. Người phản biện GS. TSKH. Trần Duy Quý